گلونینگ و بررسی ژن های کد کننده پروتئین سایکلوتاید در گیاه viola modesta fenzel

سایکلوتایدها پروتئین های غیر عادی هستند که اولین بار در سال 1970 در مطالعه ای که روی خواص دارویی گیاه آفریقایی بنام kalata-kalata oldenlandia affinis)) انجام شده بود شناسایی شدند . ساختار پروتئینی در سایکلوتایدها خاص و منحصر به فرد است و باعث پایداری پروتئین در برابر تجزیه شیمیایی، دمایی و آنزیمی شده است ]8[. انتهای آمینی و کربوکسیلی این پروتئین ها توسط پیوند پپتیدی بهم متصل شده اند و در نتیجه ساختاری حلقوی پدید آورده اند. این پروتئین های حلقوی شامل تقریباً 30 اسید آمینه هستند که در این 30 اسید آمینه 6 عدد سیستئین وجود دارد که دو به دو توسط پیوند دی سولفیدی به هم متصل شده اند و در نتیجه پروتئین سایکلوتاید دارای سه پیوند دی سولفید است که در ساختاری به نام گره های سیستینی حلقوی (cck) مرتب شده اند ]7[. ساختار حلقوی نقش مهمی در فعالیت و پایداری پروتئین بازی می کند وجود cck برای ثبات دمایی مهم است . نقش هایی که برای سایکلوتایدها در گیاهان تعیین شده است شامل فعالیت های ضد ایدز ]2[، مانع اتصال نوروتنسین (ناقل عصبی) به غشای سلولی ، تسهیل زایمان ، نابودی گلبول های قرمز ، فعالیت علیه سلول های سرطانی و فعالیت های حشره کشی می باشند. پیوندهای دی سولفیدی در قسمت مرکزی پروتئین قرار می گیرند و در نتیجه سطح خارجی پروتئین آب گریز است. سایکلوتایدها شامل قسمت هایی به نام ناحیه کد کننده سیگنال پپتید، ناحیه ابتدایی ، انتهای آمینی ، ناحیه سایکلوتاید بالغ و دم می باشد. اولین سایکلوتایدی که شناسایی شد kalataبود. ولی ساختار آن تا سال 1995 شناسایی نشد و فقط تا این حد می دانستند که انتهای آمینی و کربوکسیلی آن بسته است و سرانجام در سال 1995 ساختار آن شناسایی شد، در آن زمان سه پروتئین شبیه kalata به نام های سیرکولین a و سیرکولین b و سیکلوپسیکوتراید a از دو گیاه خانواده rubiaceae گزارش شدند. سایکلوتایدها به دو زیر خانواده مهم موبیوس و بریسلت تقسیم می شوند. این تقسیم بندی بر پایه حضور یا عدم حضور پرولین در حلقه پنجم است حضور این اسید آمینه باعث چرخش در ساختمان پروتئین می شود . موبیوس دارای پرولین و بریسلت فاقد آن است. تقریباً دو سوم سایکلوتایدهایی که تا کنون شناسایی شده اند متعلق به زیر خانواده بریسلت است . بریسلت ها شامل تعداد زیادی اسید آمینه کاتیونی در حلقه 5 و 6 و همچنین دارای یک مارپیچ ? در حلقه 3 می باشند. حلقه1 و 4 در هر دو زیر خانواده حفظ شده است .بعضی اسید آمینه ها مثل گلوتامات در حلقه 1 و هر شش سیستئین به طور قابل توجهی در هر دو زیر خانواده حفظ می باشند. تغییراتی شامل برش های آنزیمی،تشکیل باند های دی سولفید و اتصال ابتدا و انتهای پروتئین به هم باعث تشکیل ساختاری حلقوی در سایکلوتاید ها می شود ]13[. ناحیه انتهایی آمینی دارای ساختار مارپیچ آلفا است و در تغییرات پس از ترجمه نقش دارد. اولین کلون های cdna مربوط به سایکلوتایدها توسط jennings از گیاه oldenlandia affinis بدست آمد. بیان سایکلوتایدها در طول فصل متفاوت است و همچنین در هنگام حمله پاتوژن بیان سایکلوتایدها بیشتر می شوند. ژانگ از گیاه baoshanensis viola، rna استخراج و سپس cdna سنتز نمود و به این نتیجه رسید که تعداد سایکلوتاید های بیان شده در شرایط استرس با کادمیوم بیشتر می شوند و همچنین مقدار بیان سایکلوتایدها در بافت های مختلف هم متفاوت است . تا کنون بیشترین تعداد سایکلوتاید از خانواده بنفشیان گزارش شده است ولی درباره سایکلوتاید های گونه v.modesta گزارشی در پایگاه داده وجود ندارد. به دلیل اهمیت پروتئین سایکلوتاید، در این پروژه به بررسی این پروتئین در گیاه v.modesta پرداخته شد این گیاه بومی ایران است و در منطقه کردستان یافت می شود. توالی ژنی سایکلوتاید های گزارش شده به شیوه های مختلفی بدست آمده است بیشترین روش استفاده شده برای بدست آوردن توالی سایکلوتایدی از طریق استخراج پروتئین سایکوتاید ها و آنالیز این پروتئین ها بوده است اما تعدادی هم از طریق مطالعه بر روی rnaهای گیاه، توالی ژنی سایکلوتاید ها را بدست آوردند که این روش ها عبارتند از جدا سازی کلون های ناقص cdna به وسیله rt-pcr با استفاده از پرایمر پیشرو و کامل کردن طول cdna ها با کمک نمایش کتابخانه cdna و یا تکنیک race [، پرایمر دژنره از ناحیه حفظ شده aafalpa که در ناحیه سیگنال شبکه اندوپلاسمی قرار دارد، طراحی می شود. در این پروژه 14 ژن سایکلوتاید جدید با تکنیک 3race و پرایمر پیشرویی که از ناحیه aafalpa طراحی شده بود، از گیاه v.modesta بدست آمد.